Ellman’s Reagent (DNTB,pH 8.0)
含DNTB的Ellman试剂，pH 8.0，用于检测巯基与半胱氨酸含量。
产品货号：ED-8482
货期：1-2天
包装单位：盒
ED-8482 Ellman’s Reagent (DNTB,pH 8.0) 由DingZ BIO提供，盒装规格，现货供应。属于其它缓冲液类生物科研试剂，品质稳定可靠，适用于科研院所与生物医药企业，快速交付。
配方组成
| 成分 | 终浓度 |
|---|---|
| Na2HPO4·12H2O | 93.2 mM |
| NaH2PO4·2H2O | 6.8 mM |
| EDTA-2Na·2H2O | 1 mM |
| DTNB（Ellman试剂） | 4 mg/mL |
| pH | 8.0 |
浓度为成品中的终浓度。需要不同浓度、pH 或规格，可点上方「基于此产品定制」。
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保存条件
4ºC保存，有效期一年。Ellman's Reagent与Cysteine Hydrochloride Monohydrate溶解后-20ºC保存。
操作步骤
预先准备：
5×Buffer RB稀释：取100ml 5×Buffer RB加入400ml去离子水稀释至1×Buffer RB备用。
Ellman's Reagent试剂溶液：将40mg Ellman's Reagent试剂溶解在10mL 1×Buffer RB中。
1. 通过将以下浓度的Cysteine Hydrochloride Monohydrate（盐酸半胱氨酸一水合物）溶解在反应缓冲液1×Buffer RB中来制备一组半胱氨酸标准品(根据不同实验要求选择不同标准品及体系)：
标准品 | 1×Buffer RB体积 | 盐酸半胱氨酸一水合物 | 最终浓度 |
A | 100ml | 26.34mg | 1.5mM |
B | 5ml | 25ml 标准品A | 1.25mM |
C | 10ml | 20ml 标准品A | 1.0mM |
D | 15ml | 15ml 标准品A | 0.75mM |
E | 20ml | 10ml 标准品A | 0.5mM |
F | 25ml | 5ml 标准品A | 0.25mM |
G | 30ml | 0ml | 0.0mM(空白组) |
2. 准备一组试管，每个试管含有50μl Ellman Reagent试剂溶液和2.5ml反应缓冲液1×Buffer RB。
3. 将250μL的每种标准品或待测物加入步骤2中制备的单独试管中，总体积2.8ml。
注意：对于未知物进行稀释，使应用于测定反应的250μL样品在标准曲线的工作范围内具有巯基浓度（0.1-1.0mM是理想的）。
4. 混合并在室温下孵育15分钟。
5. 测量412nm处的吸光度。
6. 绘制为标准品获得的值以生成标准曲线。从该曲线确定实验样品浓度。
计算示例：使用1cm分光光度比色皿将250μL未知物等分试样与2.5mL反应缓冲液1×Buffer RB和50μL Ellman Reagent试剂溶液混合，得到0.879的吸光度（减去空白后）。计算巯基浓度，单位为μmol/mL未知物。已知TNB在412nm处的缓冲系统中的摩尔吸收率（摩尔消光系数，以M-1cm-1为单位表示）为14,150。
A = 吸光度，b =以厘米为单位的比色皿长度，c = 以摩尔/升为单位的浓度（=M）
求解浓度公式为：c=A/bE
本例中：A = 0.879，b = 1cm，Ε = 14,150M-1cm-1。因此，c = 0.879 /(1×14,150)= 6.21×10−5M
如果检测浓度为：6.21×10−5M，则2.8ml溶液中含有：2.8×10-3L×( 6.21×10−5moles/L)=1.74 ×10−7 moles.
测定溶液中这些 1.74 x 10-7 摩尔的巯基是由原始的0.25mL样品贡献的。因此，原始未知样品中游离巯基的浓度为：
(1.74 ×10−7moles)/(0.25×10−3L) 1000mL = 6.96 ×10−4 M
参考文献
Riddles, P.W., et al. (1979) Ellman’s reagent: 5, 5 ́-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Anal Biochem 94:75-81.
Kuwata, K., et al. (1982) Liquid chromatographic determination of alkylthiols via derivatization with 5, 5’- dithiobis(2-nitrobenzoic acid). Anal Chem 54:1082-7.
Masamune, S, et al. (1989) Bio-Claisen condensation catalyzed by thiolase from Zoogloea ramigera. Active site cysteine residues. Chemtracts- Organic Chem 2:247-51.